導(dǎo)讀：近日，國際知名期刊《Advanced Drug Delivery Reviews》（IF=15.606）發(fā)表的綜述文章，對目前實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的核酸突變分析方法進行了介紹，來自美國萊斯大學(xué)的DmitriyKhodakov教授認為，在未來一段時間內(nèi)PCR技術(shù)仍然是核酸突變位點檢測的不二選擇，其中在PCR技術(shù)領(lǐng)域，艾德生物ARMS技術(shù)獲得國際認可，成為綜述中提及的中國公司。以下是《生物谷》原文。
核酸突變分析方法抉擇：PCR、雜交、NGS？
日前，以"精細管理、精準醫(yī)療"為主題的2016屆CSCO學(xué)術(shù)年會在廈門落下帷幕，精準檢測作為臨床實踐中實施精準醫(yī)學(xué)的第一步，成為本屆CSCO學(xué)術(shù)年會的熱點話題。來自不同企業(yè)的分子診斷技術(shù)百花齊放百家爭鳴，面對新技術(shù)與成熟技術(shù)的較量，在"精準醫(yī)學(xué)"時代下，如何選擇合適的檢測技術(shù)，實現(xiàn)精準治療成為新醫(yī)學(xué)形態(tài)下人們亟需解決的問題。
近期，美國萊斯大學(xué)DmitriyKhodakov教授在國際知名期刊《Advanced Drug Delivery Reviews》（IF=15.606）發(fā)表的綜述文章，也許能給我們一個答案。該文對精準醫(yī)學(xué)關(guān)鍵的基因檢測技術(shù)手段進行了梳理，作者認為目前實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的核酸檢測技術(shù)可以分為三大類：PCR技術(shù)、雜交技術(shù)和測序技術(shù)，介紹了這三類技術(shù)，并對其臨床應(yīng)用發(fā)表了自己的見解。以下是對該文主要內(nèi)容的介紹。
一、PCR技術(shù)
PCR技術(shù)是目前廣泛應(yīng)用的DNA分子檢測技術(shù)。與雜交技術(shù)和測序技術(shù)相比，PCR技術(shù)優(yōu)勢主要在于、高敏感度、易于推廣。其主要局限在于多重基因聯(lián)合檢測時可涵蓋的基因數(shù)量受限。
1、ARMS
擴增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）是使用廣泛的一種核酸變異檢測技術(shù)，已有多家公司開發(fā)出基于此技術(shù)的腫瘤突變基因檢測試劑盒產(chǎn)品，如Qiagentherascreen、Roche Cobas、BiomerieuxTHxID以及中國的AmoyDx等。
2、Blocker PCR
Blocker PCR技術(shù)通過引入blocker序列來抑制野生型基因擴增從而達到檢測核酸變異位點的目的。目前已有基于此技術(shù)的腫瘤基因突變檢測試劑盒產(chǎn)品問世，如PNA Bio開發(fā)的PNAClamp試劑盒。
3、多重PCR
多重PCR技術(shù)需要解決擴增抑制、熒光基團的數(shù)量限制、引物二聚體等問題，其工程學(xué)解決方案主要通過開發(fā)設(shè)備和一次性芯片等來解決。Biofire Diagnostics(現(xiàn)被Biomerieux收購)和Cepheid都開發(fā)出用于感染性疾病診斷的多重PCR試劑和儀器。
4、數(shù)字PCR
數(shù)字PCR技術(shù)通過將一個樣本分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子(DNA模板)，在每個反應(yīng)單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進行統(tǒng)計學(xué)分析，從而實現(xiàn)高靈敏的絕對定量檢測。目前數(shù)字PCR主要用于科研及臨床研究，也有開發(fā)LDT方法用于臨床，如Trovagene PCMBRAFV600E試驗。
二、雜交
雜交是一種將合成的DNA探針或引物與目標序列結(jié)合的過程。與PCR技術(shù)和NGS技術(shù)相比，雜交的主要優(yōu)點在于操作簡單、可多重檢測、結(jié)果可靠，其缺點主要在于該方法不能進行序列擴增，因此必須依賴于信號放大技術(shù)或者高靈敏的檢測設(shè)備。
1、微矩陣
微矩陣通過靶基因與固定在芯片上的探針發(fā)生特異性雜交，結(jié)合在芯片上不同位置的探針對應(yīng)不同突變，熒光強度代表濃度，從而實現(xiàn)一次檢測多種基因突變或者基因表達水平的目的。因此，其檢測靈敏度取決于靶基因和探針的雜交效率及熒光顯微鏡的分辯能力。FDA已批準多個微矩陣技術(shù)產(chǎn)品，如Agendia開發(fā)的用于乳腺癌檢測的MammaPrint試劑盒等。
2、熒光條形碼單分子檢測技術(shù)
熒光條形碼單分子檢測技術(shù)是一種高通量檢測技術(shù)。可分為兩大類：intensity barcodes和geometric barcodes，intensity barcodes在二氧化硅顆粒上標記不同密度的熒光標記，通過捕獲有目標基因的顆粒的熒光信號來檢測突變類型；而geometric barcodes是利用光譜上不同的熒光基團的組合來檢測不同序列。其中Luminex開發(fā)的基于intensity barcodes方法的呼吸道疾病診斷技術(shù)已獲得FDA批準。
3、原位雜交（ISH）
原位雜交不僅提供目標基因的序列和濃度信息，而且可實現(xiàn)目標基因的細胞定位，尤其適用于異質(zhì)性細胞及組織樣本的基因擴增檢測。原位雜交技術(shù)有熒光原位雜交（FISH）、顯色原位雜交（CISH）或者銀染原位雜交（SISH）等，原位雜交技術(shù)可應(yīng)用于DNA和RNA的檢測，目前，F(xiàn)ISH主要用于DNA擴增檢測，如Roche和Abbot開發(fā)的HER2擴增檢測試劑盒。
三、新一代測序技術(shù)（NGS）
NGS是一種高通量檢測DNA和RNA變異的方法，與Sanger測序不同，NGS可檢測多種樣本，且可以同步提供大量的基因變異信息，因此該方法非常適合于并行檢測和分析多種基因和變異信息。
沒有一種方法是完美的，由于背景信號干擾、酶的擴增錯誤率、化學(xué)反應(yīng)不徹底等問題，所有的NGS平臺都有一定的內(nèi)在錯誤率。而測序過程中的錯誤會增加突變檢測的難度，特別是低頻突變。
1、主流NGS平臺
主流NGS平臺有Illumina和IonTorrent的的NGS系統(tǒng)，Illumina在序列錯誤率和成本控制上處于優(yōu)勢地位。在診斷應(yīng)用方面，Illumina開發(fā)有Miseq和NextSeq兩個平臺，其中MiseqDx是已獲得FDA許可用于IVD的NGS平臺。
2、其他平臺
其他平臺還有：適用于長序列檢測的SMRT NGS平臺（Pacific Bioscience），以及Nanopores NGS平臺（Oxford、Genia Technologies）等。
四、作者觀點
NGS實驗操作復(fù)雜且成本高，由于其高通量的序列分析能力，已經(jīng)成為許多序列變異分析與科研應(yīng)用的主要選擇。然而，從臨床診斷應(yīng)用的角度，檢測的目標位點必須具有明確的臨床價值，因此相對于NGS技術(shù)而言，PCR技術(shù)的簡便性、穩(wěn)定性和使用的廣泛程度意味著在未來一段時間內(nèi)PCR技術(shù)依然是核酸突變位點檢測的不二選擇。
在可預(yù)見的未來里，技術(shù)的發(fā)展將扮演重要的角色。雖然NGS技術(shù)單位通量價格在近10年極大地降低，但是依然離整個基因組或轉(zhuǎn)錄水平的全面深度測序至少6個數(shù)量級的差距。DNA序列變異分析的優(yōu)化和創(chuàng)新將主要集中在價格，準確性，運行周期，操作復(fù)雜度和實驗室的規(guī)范化等方面。
原文：DmitriyKhodakova, 1, ChunyanWanga, 1, David Yu Zhanga, b, Diagnostics based on nucleic acid sequence variant profiling: PCR, hybridization, and NGS approaches，Advanced Drug Delivery Reviews 105 (2016) 3-19.（來源：生物谷Bioon.com）
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廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司（股票代碼：300685）聚焦在腫瘤精準醫(yī)療分子診斷領(lǐng)域，專注于科技惠民的技術(shù)創(chuàng)新，致力為患者提供合規(guī)、高品質(zhì)的診斷產(chǎn)品和服務(wù)，讓患者從精準醫(yī)療中真正獲益。公司擁有國家企業(yè)技術(shù)中心、工信部專精特新小巨人企業(yè)、國家級制造業(yè)單項冠軍企業(yè)、博士后科研工作站、發(fā)改委基因檢測技術(shù)應(yīng)用示范中心、國家高新技術(shù)企業(yè)、福建省腫瘤高通量測序工程研究中心等資質(zhì)，GMP標準廠房獲得國家藥監(jiān)局（NMPA）和歐盟ISO13485資質(zhì)認證；公司擁有ADx-ARMS?、Super-ARMS?、ddCapture?、ADx-HANDLE?等核心技術(shù)，核心技術(shù)獲得中國、美國、歐盟、日本授權(quán)，榮獲國家科學(xué)技術(shù)進步獎二等獎、中國專利獎銀獎；公司產(chǎn)品覆蓋具備精準醫(yī)療條件的各大癌種，多個產(chǎn)品至今尚無競品，除了在國內(nèi)三甲醫(yī)院大規(guī)模應(yīng)用外，部分產(chǎn)品在日本、韓國獲批上市并進入當(dāng)?shù)蒯t(yī)保，開創(chuàng)了我國腫瘤伴隨診斷海外獲批的先例。此外，公司下設(shè)廈門艾德醫(yī)學(xué)檢驗所、上海廈維醫(yī)學(xué)檢驗所，擁有醫(yī)療機構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證、通過美國病理學(xué)會（CAP）認證和ISO15189認可，專業(yè)從事第三方臨檢服務(wù)。目前全球數(shù)十個國家和地區(qū)的客戶選擇了艾德產(chǎn)品和服務(wù)，每年有數(shù)十萬腫瘤患者從中受益。此外，公司瞄準行業(yè)創(chuàng)新源頭，以伴隨診斷賦能原研藥物臨床，是眾多頂級藥企腫瘤藥物開發(fā)的戰(zhàn)略合作伙伴，是國際知名的民族品牌。